原始生殖細(xì)胞（primordial germ cell，PGC）是精子和卵子在胚胎期的祖先細(xì)胞（progenitor cell），是遺傳物質(zhì)代際傳遞的細(xì)胞載體。因此，PGC是開展基因編輯和轉(zhuǎn)基因等遺傳操作的理想靶細(xì)胞。將遺傳操作后的PGC移植入內(nèi)源PGC剔除的受體胚，利用受體高效產(chǎn)生遺傳操作的供體配子，可提升遺傳操作的效率，有望獲得致死基因的母源合子突變體，并有可能通過跨物種的PGC移植實(shí)現(xiàn)種間借腹生殖，突破精準(zhǔn)高效的定向育種。因此，PGC移植技術(shù)已成為動(dòng)物遺傳操作和定向育種領(lǐng)域亟待突破和發(fā)展的重要技術(shù)。?

然而，供體胚胎往往僅具有極少數(shù)目的PGC，如1000-細(xì)胞期的斑馬魚胚胎僅有4顆PGC（圖1），限制了PGC移植的成功率。建立一種普適高效的PGC誘導(dǎo)技術(shù)，成為這一領(lǐng)域亟待解決的首要科學(xué)和技術(shù)難題。在動(dòng)物界，PGC特化存在兩種不同的模式。一是以小鼠為代表的“后成論”（Epigenesis），是指周圍信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞團(tuán)獲得PGC特性；另一個(gè)是以果蠅、秀麗隱桿線蟲、斑馬魚和非洲爪蟾為代表的“先成論”（Preformation），是指從母體繼承的生殖質(zhì)（germplasm）因子直接決定生殖細(xì)胞命運(yùn)。在“后成論”動(dòng)物中，已有少量誘導(dǎo)型PGC（induced PGC，iPGC）的報(bào)道，但在“先成論”動(dòng)物中尚未取得iPGC的突破。?

中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所孫永華團(tuán)隊(duì)致力于魚類生殖細(xì)胞發(fā)育與生物技術(shù)研究。前期，研究以斑馬魚和稀有鮈鯽為模型，初步建立了魚類單因子PGC異位誘導(dǎo)和跨亞科物種間生殖干細(xì)胞移植借腹生殖技術(shù)。12月14日，孫永華團(tuán)隊(duì)在《自然-通訊》（Nature Communications）上，發(fā)表了題為Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors的研究論文。該研究首次采用“先成論”策略在斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎中高效誘導(dǎo)出iPGC，為硬骨魚類的PGC誘導(dǎo)和PGC移植借腹生殖建立了新范式。?

為了高效地誘導(dǎo)魚類PGC，該研究將與PGC特化密切相關(guān)的9個(gè)生殖質(zhì)因子（9GM：ddx4、dazl、piwil1、dnd1、nanos3、tdrd6、tdrd7a、dazap2、buc）和與PGC遷移相關(guān)的4個(gè)因子（4GM：rgs14a、cxcr4a、cxcr4b、ca15b）一同注射到1-細(xì)胞的斑馬魚胚胎中，發(fā)現(xiàn)幾乎所有胚盤細(xì)胞都變成GFP-UTRnanos3陽(yáng)性的類PGC細(xì)胞。去除與PGC遷移相關(guān)的4因子后，9GM仍可高效的誘導(dǎo)出類PGC細(xì)胞。將誘導(dǎo)的類PGC細(xì)胞移植到內(nèi)源PGC剔除的受體胚中，類PGC可以正確遷移到生殖嵴（圖2），且起始表達(dá)內(nèi)源生殖質(zhì)基因，表明這些類PGC具有典型的PGC特征，是真正的iPGC。?

進(jìn)一步，該研究使用Tg(cmv:GFP)和Tg(cmv:mCherry)轉(zhuǎn)基因胚胎分別作為iPGC移植的供體和受體。研究通過連續(xù)追蹤iPGC移植性腺的發(fā)育，發(fā)現(xiàn)嵌合體性腺生殖細(xì)胞均表達(dá)GFP，性腺體細(xì)胞均表達(dá)mCherry。研究利用表達(dá)mCherry的親本產(chǎn)出了表達(dá)GFP的iPGC移植配子，其子代也可正常發(fā)育和繁殖。這表明iPGC移植后能夠正常發(fā)育為成熟的配子。為了進(jìn)一步證明9個(gè)生殖質(zhì)因子能夠?qū)⑷魏我粋€(gè)胚胎細(xì)胞誘導(dǎo)為iPGC，科研人員嘗試將9GM注射入128-細(xì)胞時(shí)期的斑馬魚胚胎的單個(gè)胚盤細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)無論注射到動(dòng)物極還是胚盤邊緣的單胚盤細(xì)胞，9GM均可將該胚盤細(xì)胞誘導(dǎo)為iPGC，并進(jìn)一步產(chǎn)生功能性配子，表明9GM能夠?qū)⑷我慌弑P細(xì)胞誘導(dǎo)成為iPGC。?

重要的是，這種誘導(dǎo)策略在不同魚類間高度保守。研究發(fā)現(xiàn)：斑馬魚來源的9GM可將稀有鮈鯽胚盤細(xì)胞高效誘導(dǎo)為iPGC；將稀有鮈鯽iPGC移植入斑馬魚胚胎后，可利用斑馬魚高效產(chǎn)出稀有鮈鯽iPGC來源的種間借腹生殖精子（圖3）。?

該團(tuán)隊(duì)試圖利用iPGC誘導(dǎo)和移植技術(shù)來解決魚類基因敲入實(shí)驗(yàn)中面臨的難題，即基因敲入效率與胚胎存活率之間的矛盾。該工作注射大劑量的基因敲入元件，以在囊胚期獲得盡可能高的基因敲入效率；通過注射9GM，將這些攜帶有大量基因敲入事件卻無法存活的胚胎細(xì)胞全部誘導(dǎo)為iPGC；再將這些iPGC移植入野生型受體胚胎，利用高存活率的野生型受體魚高效產(chǎn)生出基因敲入的配子（圖4）?；蚯萌肱ciPGC誘導(dǎo)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，從根本上提升了斑馬魚基因敲入實(shí)驗(yàn)中的種系傳遞效率。?

這一魚類iPGC誘導(dǎo)理論和技術(shù)的突破，解決了魚類PGC移植中供體PGC來源的瓶頸。這不僅為斑馬魚等魚類基因功能研究提供了更強(qiáng)大的工具，而且可用于養(yǎng)殖魚類的iPGC移植高效借腹生殖精準(zhǔn)育種。

研究工作得到國(guó)家杰出青年科學(xué)基金、國(guó)家自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究群體項(xiàng)目、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中國(guó)博士后科學(xué)基金等的支持。

本研究使用的斑馬魚和稀有鮈鯽來自國(guó)家水生生物種質(zhì)資源庫(kù)國(guó)家斑馬魚資源中心，相關(guān)載體保藏至該中心，并通過該中心對(duì)學(xué)術(shù)界提供相關(guān)資源和技術(shù)服務(wù)。?

圖1.?斑馬魚等魚類早期胚胎僅存在極少數(shù)目的PGC

圖2.?9GM將斑馬魚胚盤細(xì)胞高效誘導(dǎo)為iPGC

圖3.?稀有鮈鯽iPGC的高效誘導(dǎo)和iPGC移植種間借腹生殖

圖4.?通過iPGC誘導(dǎo)和移植顯著提升基因敲入的種系傳遞效率